Em mais uma edição do ‘Drops de Genômica’, o oncologista André Murad explica as tecnologias para análise do perfil molecular tumoral de célula única.

Por André Marcio Murad*

Avanços recentes nas tecnologias de célula única permitiram uma avaliação mais precisa do perfil molecular de alto rendimento de células de variadas modalidades e origens. Os dados transcriptômicos de célula única agora podem ser complementados pela acessibilidade da cromatina, expressão de proteínas de superfície, perfis de repertório de receptores imunes adaptativos e informações espaciais.

A crescente disponibilidade de dados de célula única em todas as modalidades motivou o desenvolvimento de novos métodos computacionais para ajudar os analistas a obter análises biológicas mais complexas. À medida que o campo cresce, torna-se cada vez mais difícil navegar no vasto cenário de ferramentas e etapas de análise.

Transcriptoma

As tecnologias de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) revolucionaram a biologia molecular, permitindo a medição de perfis de transcriptoma em escala e resolução sem precedentes.  Avanços na tecnologia experimental motivaram inovações em larga escala em métodos computacionais, levando a mais de 1.400 ferramentas atualmente disponíveis para analisar dados scRNA-seq. Estruturas computacionais e repositórios de software, como Bioconductor, Seurat e Scanpy, complementados por benchmarks de métodos e fluxos de trabalho de melhores práticas, permitiram que analistas de dados navegassem nesse espaço e construíssem canais de análise.  Essa interação de inovação experimental e computacional tem permitido muitas descobertas de marcos biológicos que revelam a heterogeneidade celular do tecido.

No entanto, o scRNA-seq captura apenas uma camada da complexa maquinaria regulatória que governa a função celular e a sinalização.  Para complementar isso, esforços consideráveis ​​foram feitos para medir outras modalidades na resolução de uma única célula, incluindo acessibilidade da cromatina, proteínas de superfície, repertórios de receptores de células T (TCR)/receptores de células B (BCR) e localização espacial, permitindo a descoberta de inúmeras assinaturas reguladoras de vários tipos de câncer, além do diabetes mellitus, resposta desregulada do sistema imunológico inato e adaptativo contra o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) e melhor compreensão dos efeitos imunossupressores do microambiente tumoral na resolução espacial. A inovação experimental levou ao desenvolvimento de várias inovadoras ferramentas computacionais para inúmeras modalidades de célula única.

Entretanto, deve-se ressaltar que a falta de fluxos de trabalho de melhores práticas torna desafiadora a navegação no vasto cenário de novas ferramentas.  Além disso, embora as melhores práticas computacionais e recomendações de ferramentas tenham sido descritas anteriormente para scRNA-seq, elas podem estar desatualizadas ou incompletas.

Acessibilidade da cromatina

A análise de elementos regulatórios é essencial para decifrar a diversidade celular e entender a tomada de decisão celular.  A expressão gênica é controlada por uma complexa interação de mecanismos regulatórios, incluindo epigenética e acessibilidade da cromatina. Para obter informações sobre a dinâmica do estado da cromatina no nível de célula única, o ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível por transposase (scATAC-seq) mede a acessibilidade da cromatina em todo o genoma em células individuais.

Expressão de proteína de superfície

A transcrição e a acessibilidade da cromatina são proxies para o estado celular, atividade e regulação.  Os produtos reais gerados, as proteínas, assumem tarefas intracelulares ou extracelulares, e um subconjunto de proteínas é apresentado na superfície celular.  A expressão de proteínas de superfície auxilia na identificação de tipos de células, como as células hematopoiéticas do sistema imunológico, cuja anotação é baseada em marcadores que geralmente são usados ​​em experimentos de citometria de fluxo ou citometria de massa.  Eles podem ser usados ​​posteriormente para validar genes geneticamente eliminados específicos usando, por exemplo, o pipeline Mixscape.  

Os protocolos mais amplamente utilizados para scRNA-seq combinado e perfis de proteínas de superfície são o CITE-seq e o REAP-seq, com a principal diferença sendo as etiquetas derivadas de anticorpos (ADTs) que são usadas para quantificar os níveis de expressão de proteínas de superfície.